Ce dessin d'un format relativement petit, exécuté à la plume et au lavis d'encre brune sur des tracés à la pierre noire, à l'intérieur d'un trait d'encadrement à la plume, est rehaussé de gouache blanche. 

Sujet souvent illustré par les artistes à l'époque moderne, la querelle d'Apollon et Marsyas trouve sa source écrite dans Les Métamorphoses d'Ovide (livre VI, 383 - 401). La déesse Athéna ayant fabriqué une flûte double, en joue devant l'assemblée des dieux. Les moqueries d'Aphrodite et d'Héra l'alertent : elle ausculte son image dans le miroir des eaux d'une rivière, et découvre la laideur de ses joues gonflées lorsqu'elle souffle dans l'instrument. Elle s'en débarrasse aussitôt, maudissant celui qui s'en emparera. Le satyre Marsyas la trouve et, fier de sa trouvaille, en joue devant des paysans ; ils jurent qu'Apollon, le dieu de la musique, ne peut pas faire mieux avec sa lyre, ce que Marsyas ne réfute pas. Apollon, furieux, propose un concours arbitré par les Muses et le roi Midas. Le dieu l'emporte, bien que Midas se soit déclaré pour le silène : le roi se voit alors affublé d'oreilles d'ânes. Le vainqueur ayant le choix du châtiment imposé au vaincu, Marsyas sera écorché vif.
Calvaert met en scène dans ce dessin le dieu jouant seul de son instrument, une "viola da braccio" plutôt qu'une lyre, selon une tradition fréquente à partir de la Renaissance. Appolon est assis contre le tronc massif d'un arbre, le visage extatique tourné vers le ciel. Marsyas l'écoute, à demi caché derrière le tronc. Aucun élément ne suggère l'issue dramatique du conflit opposant le dieu et le satyre. C'est bien plutôt l'inspiration du musicien qui est le sujet de la composition. L'attitude de Marsyas, accroupi et comme fasciné par Appolon, semble servir de faire-valoir au dieu qui, plongé dans une inspiration quasi mystique, ignore la présence de ce spectateur.
Catherine Loisel, dans le catalogue de l'exposition de Rouen (Le génie de Bologne 2006), préférait y voir la figure d'Orphée. La présence du satyre à ses côtés semble plaider plutôt pour Apollon, le satyre - créature au buste d'homme et aux pattes de bouc - étant généralement absent lorsqu' Orphée joue de son instrument.
Le caractère achevé de ce dessin, dont témoigne la signature autographe de l'artiste, révèle qu'il s'agissait probablement, comme l'a souligné Catherine Loisel, d'une feuille destinée à une clientèle d'érudits, aux goûts sophistiqués. L'oeuvre n'est pas une étude mais revêt ainsi une valeur intrinsèque et autonome. Deux siècles plus tard, elle ne pouvait que séduire Babinet, toujours attiré par des dessins à la technique quasi picturale, fouillés et aboutis.